产品货号:
SY0802
中文名称:
活性氧(ROS)检测试剂盒
英文名称:
Reactive Oxygen Species Assay Kit
产品规格:
1000T
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本试剂盒是一种基于荧光染料DCFH-DA的荧光强度变化,定量检测细胞内活性氧水平的最常用方法。DCFH-DA本身没有荧光,可以自由穿过细胞膜。进入细胞内后,可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH,而DCFH不会通透细胞膜,因此探针很容易被积聚在细胞内。细胞内的活性氧能够氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。绿色荧光强度与活性氧的水平成正比。在最大激发波长480nm,最大发射波长525nm处,使用荧光显微镜,流式细胞仪或激光共聚焦显微镜等检测荧光信号。Rosup为活性氧阳性诱导药物,根据其荧光信号强度,可分析活性氧的真正水平。
保存:-20℃干燥保存,避免强光直射。有效期一年。
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组分 | 规格 |
DCFH-DA(10mM) | 100μL |
活性氧阳性对照(Rosup,100mM) | 10mL |
保存:-20℃干燥保存,避免强光直射。有效期一年。
- 探针装载后,一定要洗净残余的未进入细胞内的探针,否则会导致背景较高。
- 探针装载完毕并洗净残余探针后,可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描,以确认探针的装载情况是否良好。
- 尽量缩短探针装载后到测定所用的时间(刺激时间除外),以减少各种可能的误差。
- 装载探针
- 原位装载探针(仅适用于贴壁细胞)
- 细胞准备:检测前一天进行细胞铺板,确保检测时细胞汇合度达到50~70%。
注:必须保证细胞状态健康,且检测时不会过度生长。 - 药物诱导:去除细胞培养液,加入适量经合适的缓冲液或无血清培养基稀释到工作浓度的药物,于37℃细胞培养箱内避光孵育,具体诱导时间根据药物本身特性,以及细胞类型来决定。
(可选)阳性对照:先用无血清培养基等稀释阳性对照(Rosup,100mM)到常用工作浓度100μM,加入细胞,一般37℃避光孵育30min-4h可显著看到活性氧水平提高,但依细胞类型会有比较明显差异。如,HeLa细胞孵育30min;MRC5人胚胎成纤维细胞1.5h; - 探针准备:探针装载前按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA,使其终浓度为10μM。
- 探针装载:吸除诱导用药物,加入适当体积稀释好的DCFH-DA工作液。加入的体积以能充分盖住细胞为宜。例如,对于6孔板通常不少于1000μL,对于96孔板通常不少于100μL。37℃细胞培养箱内避光孵育30min。
- 细胞清洗:用无血清培养液洗涤细胞1~2次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
- 细胞准备:检测前一天进行细胞铺板,确保检测时细胞汇合度达到50~70%。
- 收集细胞后装载探针:适用于贴壁细胞和悬浮细胞。
- 细胞准备:按照标准方法培养细胞,必须保证检测用细胞状态健康。按照适当方法,清洗并收集足量的细胞。
- 药物诱导:将收集好的细胞悬浮于适量稀释好的药物,于37℃细胞培养箱内避光孵育,具体诱导时间根据药物本身特性,以及细胞类型来决定。
(可选)阳性对照:先用无血清培养基等稀释阳性对照(Rosup,100mM)到常用工作浓度100μM,加入细胞,一般37℃避光孵育30min-4h可显著看到活性氧水平提高,但依细胞类型会有比较明显差异。如,HeLa细胞孵育30min;MRC5人胚胎成纤维细胞1.5h; - 探针准备:探针装载前,按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA,使其终浓度为10μM。
- 探针装载:去除细胞内药物,离心收集细胞,加入适当稀释好的探针,使其细胞密度为1.0×106~2.0×107。
注:细胞密度需根据后续的检测体系,检测方法,以及检测总量来进行调整。如,对于流式分析,单管检测内细胞数目不少于104,也不可多于106。每隔3~5min颠倒混匀一下,使探针和细胞充分接触。 - 细胞清洗:用无血清细胞培养液洗涤细胞1~2次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
- 细胞准备:按照标准方法培养细胞,必须保证检测用细胞状态健康。按照适当方法,清洗并收集足量的细胞。
- 原位装载探针(仅适用于贴壁细胞)
- 检测
原位装载探针法:激光共聚焦显微镜直接观察,或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
收集细胞后装载探针:用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测,也可以用激光共聚焦显微镜直接观察。 - 参数设置
使用488nm激发波长,525nm发射波长,实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似,可以用FITC的参数设置检测DCF。DCF的激发光谱和发射光谱参考下图。
- 对于刺激时间较短(通常2h以内)的细胞,也可先装载探针,后用活性氧阳性对照和/或感兴趣药物刺激细胞,如阳性对照刺激,应先加入适量探针于37℃避光孵育30min;然后再加入等体积2×阳性对照Rosup溶液(200μM),37℃避光诱导30min-4h;
- 阳性对照Rosup通常浓度为100μM。通常刺激后30min-4h可以观察到显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞,活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30min内观察不到活性氧的升高,可延长诱导时间或适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快,可缩短诱导时间或适当降低活性氧阳性对照的浓度。
- 对于某些细胞,如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强,可以按照1∶2000~1∶5000稀释DCFH-DA,使装载探针时DCFH-DA的浓度为2~5μM。探针装载的时间也可以根据情况在15~60min内适当进行调整。
- 活性氧阳性对照(Rosup)仅仅用于作为阳性对照的样品,并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照。
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